PMF & Primer design

Peptide Mass Fingerprint (PMF) & Primer design


ตัวอย่างด้านล่างเป็น PMF 6 รูปแบบเพื่อนำไปหา
· Possible protein
· pI & Molecular weight (MW)
· Design primer

1. ไปยัง Web ของ Mascot ซึ่งเป็นฐานข้อมูลของ Peptide finger print http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF
จากนั้น set ค่าต่าง ๆ ดังนี้
Database >> NCBI, Enzyme >> Trypsin, Allow up to >> 3,
Fixed modification >> Carbamidomethyl (C), Variable modification >> Oxidation (M) สุดท้ายนำค่า PMF ใส่ใน
ช่อง Query กด Start search
2. จะได้ผลลัพธ์เป็นโปรตีนที่เป็นไปได้มากที่สุดในลำดับแรก
3. Click ที่ accession number ของโปรตีนนั้นเพื่อ link ไปยังฐานข้อมูล NCBI จากนั้นเลือก tBlastn เพื่อหา RNA sequence ของโปรตีนนี้
4. ผลลัพธ์ของการ blast จะได้ชื่อโปรตีนเดียวกันแต่จะได้ sequence เป็น nucleotidesจากนั้นเลือก FASTA เพื่อให้ได้ FASTA format นำไปใช้ในการออกแบบ Primer ต่อไป
5. การออกแบบ Primer จะใช้
Web tool -Primer3
http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
ใส่ sequence ที่ได้จากข้อ 4 ลงไปจากนั้น click “Pick primer”
6. ได้ Primer พร้อมคุณสมบัติของ primer (Tm, GC content)
และตำแหน่งที่ primer จับ
7. การหาค่า pI และ MW ใช้ Web tool ของ Expasy
โดยใส่ amino acid sequence เข้าไป
http://br.expasy.org/tools/pi_tool.html
คำตอบของทั้ง 6 PMF เป็นดังนี้
1. Oryza sativa (japonica cultivar-group)
pI/Mw: 6.63 / 54648.02
Lt/Rt Primers: AATTGCAAAGCGATTCTTGG / CCCTTTTGAGGTGTTGTGGT

2. Arabidopsis thaliana ALDH10A9; 3-chloroallyl aldehyde dehydrogenase/ oxidoreductase (ALDH10A9) mRNA
pI/Mw: 5.39 / 54918.20
Lt/Rt Primers: GGACATGGATGATGTTGCTG / GTGAAGGAGCGACTTTCCAG

3. Influenza A virus (A/Thailand/Chaiyaphum/622/2004(H5N1)) segment 6 neuraminidase (NA) gene
pI/Mw: 6.63 / 47294.14
Lt/Rt Primers: GTGTCCTCTAACGGGGCATA / CTCCCGCTATATCCTGACCA

4. Influenza A virus (A/Chicken/Hong Kong/YU563/01 (H5N1))
M1 protein (M1) gene
pI/Mw: 9.45 / 27931.21
Lt/Rt Primers: GGCCAGCACTACAGCTAAGG / CACTCCCATTCGTTTCTGGT

5. Heteropneustes fossilis growth hormone (GH) mRNA
pI/Mw: 5.97 / 22537.86
Lt/Rt Primers: GCTCTTCAACAACGCAGTCA / CAGCAGTTTCAGCACAGAGC

6. Synthetic construct mini-proinsulin (M2PI) gene
pI/Mw: 7.78 / 6923.95
Lt/Rt Primers: CAACCAACATTTATGTGGATCA / TCAACAATACCACGTTTTCCA

รายชื่อสมาชิก กลุ่ม 2
นพ. อภิรมย์ วงศ์สกุลยานนท์
พญ. ชนัดดา ด่านพิษณุพันธ์
นส. ศิริวิมล ฤาชา
นส. ศราวัลย์ จันทร์เทศ
นาย ปฐมพงษ์ สถาพรพงษ์
นส. ปัทมวรรณ ประไพทอง
นาย สุรพงษ์ คล้ายบุตร
นาย ณัฐพล พงษ์ประสิทธิ์